數字PCR實操結果及體會的特異性！ 導讀：多年來，研究人員一直缺乏工具，來高效拷問這些差異，不過今非昔比。有了新一代DNA測序儀和質譜儀，研究人員能夠以更高的分辨率、深度和通量來探索各個細胞之間的差異，特別是在單細胞轉錄組水平。
將細胞培養板上的細胞放在顯微鏡下觀察。表面上，它們都一樣。實際上，它們一點都不相同。無論是DNA或RNA的水平，還是蛋白質或代謝物的水平，這些細胞相差甚遠，而這些差異可能對細胞行為產生深遠的影響。
多年來，研究人員一直缺乏工具，來高效拷問這些差異，不過今非昔比。有了新一代DNA測序儀和質譜儀，研究人員能夠以更高的分辨率、深度和通量來探索各個細胞之間的差異，特別是在單細胞轉錄組水平。
單細胞捕獲
目前，人們通常采用三種方法來分離單細胞。一種是熒光激活細胞分選（FACS），其中帶有特定熒光標記的細胞才會激活熒光檢測器。這些細胞隨后進入收集板中，每個細胞占一個孔，而其余的細胞被丟棄。
據BDBiosciences的生物科學副總裁RobertBalderas介紹，FACS在單細胞分離上實現了其他方法的控制水平，這要歸功于不同顏色帶來的高分辨率。“這是一種二元的方法。如果有兩種顏色和兩種抗體，那么有四種可能性；如果是20種顏色，那么有220萬個組合，”他說。
近，Broad研究院的LeviGarraway及其同事就采用了一種簡單的方案，利用CD45的表達和細胞活力來分析人黑色素瘤中4645個腫瘤、免疫和基質細胞的轉錄組3。
BDBiosciences的款儀器，FACSymphonyA5細胞分析儀，提供了50個通道的分辨率（48種顏色再加正向和側向散射），理論上有1.1萬億個組合。據Balderas介紹，目前研究人員已利用這個平臺來區分30個通道，而40色的panel應該很快面世。
單細胞分離的另一種方法是顯微操作，它利用玻璃微針，每次捕獲一個細胞，并轉移到目的容器中。這個過程可手動開展，或通過自動化系統開展，適合低復雜度的樣品，但略顯沉悶。
一個選擇是微流體，比如Fluidigm的C1單細胞制備系統。與的Single-CellmRNASeqHT芯片相結合，C1可平行捕獲800個細胞，并開展RNA分離和cDNA合成。這家公司的Polaris™系統也具有捕獲、培養、刺激和制備樣品的能力，可平行處理48個細胞，從而使研究人員能夠探索單個細胞的功能。
文獻中也經常報道新的微流體設計。今年1月，麻省理工學院的ScottManalis及其同事介紹了一種微流體“流體力學捕獲芯片”，能夠捕獲和培養細胞；之后隨著免疫細胞的生長和分裂，比較各代之間的轉錄變化1。
在分離出單個細胞后，研究人員可采用多種工具來定量基因表達水平。就目前而言，的也許是單細胞RNA-Seq，或者它的衍生形式–單核RNA-Seq，其中單個細胞核被分離出來并測序2。
下一步分析
10XGenomics公司近在BioRxiv預印本網站上介紹了一種特別高通量的RNA-Seq方法。它基于GemCode技術，可以對每個樣品中數萬個單細胞的3’mRNA進行計數。這家公司用它來分析68000個外周血單核細胞，并根據其轉錄特征來分級，檢測到所有預期的細胞種類（如T細胞、B細胞和自然殺傷細胞等）。
另一種流行的方法是單細胞qPCR。當然，研究人員也經常用RNA原位雜交及相關方法。AdvancedCellDiagnostics的醫療官RobMonroe認為，在驗證RNA-Seq和PCR表達分析時，RNAISH特別有用，因為它在細節上的優勢彌補了通量上的不足。
RNAISH“沒有新一代測序的通量或多重分析能力”，Monroe說。“不過你獲得的東西也同樣重要：它們能夠看到RNA在組織背景、細胞的形態學背景以及周圍組織中的表達。”
AdvancedCellDiagnostics的RNAscope是一種新型的RNAISH技術。兩條相鄰的“Z探針”在特定轉錄本上雜交，為高度分支的檢測探針樹的組裝提供了支架，這實現了信號放大。Monroe表示，單次結合可作為400個探針分子的支架，從而使信號放大400倍。利用顯色試劑可拷問兩個不同的RNA目標，而利用熒光試劑可拷問三個。
的華裔學者、哈佛大學的莊小威教授將RNAISH延伸到每個細胞中的1000個轉錄本。她的團隊開發出一種名為MERFISH（多重容錯熒光原位雜交）的方法，為每個轉錄本分配一個*的16位條形碼，然后通過一系列雜交、成像和淬滅的步驟來讀取4。
在一篇發表于《NatureMethods》的評論文章中，賓夕法尼亞大學的JimEberwine及其同事寫道，“盡管單細胞測序讓人們無比興奮，但它仍不是一種常規的實驗操作。基本技術以及數據分析和解釋的改進對精確測定很重要，同時需要大樣本量來了解單個細胞的作用”5。
其他的單細胞方法也是如此。隨著文獻中出現越來越多的改進，相信更多的研究人員會踏上單細胞分析之路。隨之而來的，將是更多隱藏在大規模培養物背后的生物學秘密被揭開。
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